The construction of a mammalian tranfection vector for expression of cytosine-5 specific DNA methyltransferase gene M.Msp1 in cultured cells

Abstract

Ekspresyon vektörleri normal yada rekombine bir genin istenilen hücreye aktarılması, ekspresyonu ve proteinin saflastırılmasına olanak saglayacak sekilde olusturulurlar. Günümüzde mem hücrelerin transient yada stabil gen transferi için kullanılan ve yapılarında tasıdıkları antibiyotik dirençlilik geni ile hücre seçilimleri kolaylıkla yapılabilen birden fazla vektör bulunmaktadır. Bunlardan pCDM8 ve türevleri, pcDNAI/Ampisilin ökaryotik hücrelerde, pRC/CMV, pcDNA3 ve pRC/RSV vektörleri ise memeli hücre transfeksyonunda en yaygın kullanılan vektörlerdir. Bu arastırmada, memeli hücreleri yapısında bakteri (Moroxella spp.) monospesifik sitozin-5 DNA metiltransferaz (MTaz) M.Msp1 geni tasıyan, yeni olusturulmus memeli gen transfer vektörü ile transfekte edildi ve gen ekspresyonları yapıldı. Bunun için, COS hücreleri ekspresyonunda kullanılan vektöre analog, stabil ve trasient gen transferinde kullanılabilir bir vektör olusturuldu. PCR ile birlikte amplifiye edilen bakteriyel sitozin-5 MTaz, omurgalı nükleer transport sinyali (NLS) SV40 VP1 ve markır enzim glutatyon-S-transferaz (GST) genleri ökaryotik hücre transfeksiyonu için uygun bir vektör olan pcDNA3’e aktarıldı. Memeli hücrelerinde otonom replikasyon için yapısında SV40 replikasyon orijini ve güçlü sitomegalovirus ve T7 promotorları bulunan ve yeni olusturulan plasmid pOZT4 olarak adlandırıldı. Insan böbrek epitel 293 ve CHO hücreleri pOZT4 ile basarı ile transfekte deldi, enzimin hücre DNA’larını CCGG dizilerinden metilledigi saptandı.

The expression vectors are designed for expression and purification of normal or recombinant gene of interest. There is a wide variety of stable and transferable selectable mammalian expression vectors.The vector pCDM8 and its derivatives, pcDNAI/Ampicilline are widely used for cloning and analyzing of genes in higher eukaryotic cells. The vectors pRC/CMV, pcDNA3 and pRC/RSV are designed for high-level expression of recombinant genes in mammalian cells. In the present study, we have been able to transfect and express the monospecific bacterial (Moroxcella spp) cytosine-5 DNA methyltransferase (MTase) M.Msp1 gene in cultured cells within a newly constructed mammalian transfection vector. We have constructed a very efficient, stable or transferable eukaryotic expression vector analogous to the well-known expression system in COS cells. Bacterialcytosine-5 MTase gene with a vertebrate nuclear targeting signal (NLS) SV40 VP1 and marker enzyme glutathion-S-transferase (GST) genes were transferred into the eukaryotic shuttle vector pcDNA3 using a PCR based method. This novel plasmid which contains a strong cytomegalovirus and T7 promoters and the SV40 origin of replication for autonomous replication in mammalian cells wascalled pOZT4. Human kidney epithelial 293 and CHO cells were transfected with pOZT4 which was encoding the fusion gene and it was established that the genomic DNA of both cells were methylated at the CCGG sites by the active enzyme.