In vivo DNA methylation of escherichia coli DH5 and top 1OF'strains by bacterial cytosine-5 methyltransferase M. Msp1

Abstract

Kromatin düzeyinde metillenmis CpG dinükleotidleri, metil grubu tasımayan nükleotidlerin aksine bir modifiye restriksiyon enzimi olan R. Msp1 enzimine dirençlidirler. Yapısında metillenmis dinükleotid (mCpG) tasıyan bu serbest DNA aynı restriksiyon enzimince kesilmez. Bu arastırmada, metillenmis nükleotidlerin bu dirençli olma özelliginden yararlanarak baska bir bakteri türüne ait (Moroxella spp.), rekombine metiltransferaz enziminin, farklı hücrelerde benzer metilaz aktivite gösterip göstermeyecegi arastırılmak istenmistir. Bunun için izogenik olmayan iki E.coli susu (DH5a ve Top 10F’), PCR ile 5’ ucuna omurgalı nükleer transport sinyali SV40 VP1 ve markır enzim glutatyon- S-transferaz (GST) gen dizileri takılmıs bakteriyel sitozin-5-spesifik metiltransferaz (MTaz) M. Msp1 rekombinant gen füzyonu ile transforme edildiler. Transforme edilmis her iki hücre DNA’ ları R. Msp1 enzimince test edildi, rekombinant genin her iki hücre grubunda da aktif oldugu görüldü. Bir memeli gen transfer vektörü olan pcDNA3 içinde, T7 ve sitomegalovirus (CMV) promotorlarının kontrolünde enzimin tamamen aktif oldugu, in vivo DH5a ve Top10F’ hücre DNA’larında CCGG dizilerini metilledigi saptandı.

At the chromatin level, methylated CpG dinucleotides are R.Msp1 resistant compared with nonmethylated counterparts. The DNA of two E.coli strains was analyzed following transformationwith bacterial cytosine-5-methyltransferase gene M.Msp1 in mammalian transfection vector pcDNA3. Expression of the M.Msp1 was tested by R.Msp1 digestion. The results suggest that the DNA of both strains was fully methylated at the CCGG sequences, by the active enzyme under the control of T7 and cytomegalovirus (CMV) promoters. Methylated DNA can not be digested and it exhibits higher fragment sizes in 1% agarose gel in contrast to the untransformed cell DNAs in vivo.